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药物化学:HPLC制备样品高效浓缩的新思路


制备型反相高效液相色谱 (HPLC) 可分离高纯度化合物,被广泛应用于化学、制药、生物技术和生物化学行业。由于其分离纯度高,在小分子药物化合物、寡核苷酸、多肽、天然产物的药物合成中成为必不可少的纯化手段。

 

1HPLC纯化在药物中的案例


HPLC馏分是什么?

HPLC馏分是含有水和极性有机溶剂(如乙腈/水或甲醇/水),为了更好的分离杂质,反向HPLC流动相中通常会添加0.1%三氟乙酸(TFA)。


1、HPLC馏分浓缩面临的问题

药物发现中,为了建立文库或通过高通量筛选确定合适的靶标,药物合成后需要进行大量纯化、筛选、分析工作,每天需要处理大量的HPLC馏分,前处理所花费的时间高达61%

处理HPLC馏分浓缩时可能出现的瓶颈:

1. 药物种类多变,样品体积、样品容器、溶剂比例不一;

2. 样品量巨大,处理时间长;

3. 甲醇/乙腈的沸点较低,在蒸发过程容易产生暴沸;

4. 直接浓缩干燥很难得到干燥蓬松的最终产物。


2、提升效率的关键点

新药研发就是与时间赛跑,提高效率就是节省金钱。

因此,提高样品平行浓缩的效率,就必须解决样品前处理中高通量和自动化的问题,在药物发现CRO企业中尤为重要。 


高通量

为满足药物高通量筛选要求,Genevac HT-12高端智能的蒸发系统提供高通量处理量,同时处理上百个到上千个样品,上百种转子可选,满足各类化合物体积不一和高通量的浓缩需求。

转子类型

HT-12

样品通量

EZ-2 4.0

样品通量

深孔板

24*96

4*96

浅孔板

48*96

8*96

50ml烧瓶

48

8

50ml离心管

120

20

4ml小瓶

288

48

16×100mm

试管

288

48

13×100mm

试管

480

80

1.5mlEP

384

64


样品完整性

现代药物化学中,保持样品的质量和完整性非常重要。Dri-pure防暴沸技术,利用梯度真空和高转速的原理,有效防止低沸点溶剂暴沸,避免样品交叉污染。(点击查看往期内容:实力解析:如何防止混合溶剂碰撞导致的样品损失)


自动化

以下是实验室一般处理流程及Genevac的处理流程的对比图——

Genevac通过SampleGenie技术简化实验流程,直接将样品浓缩到小瓶中,避免样品转移带来的损失,并可以节约浓缩时间,以方便后续处理。

 

2:实验室一般处理流程


 

3Genevac处理流程简化方案


3、如何从HPLC馏分中高效得到干燥蓬松的最终产物?

药物研发实验室的要求是将样品干燥成蓬松的粉末状,以便准确称量样品、二次取样、复溶和储存,因此,冷冻干燥是实验的理想技术。但是常规的冷冻干燥系统一方面处理时间长,另一方面难以处理有机溶剂,因为有机溶剂很容易产生暴沸,并因此损坏真空泵,造成样品损失。而使用传统的蒸发技术难以得到蓬松的样品。


LyoSpeed™技术

快速冻干法(LyoSpeed™)是一个两全其美的方法:一种快速,能够得到彻底干燥和蓬松样品的方法。该方法同时也适用于难以干燥的样品,尤其适用HPLC馏分干燥。利用先浓缩后冻干的程序,蒸发程序包含以下阶段:

1) 使用Dri-pure防暴沸技术& 40mbar的压力下去除部分大部分有机溶剂;

2) 自动排液放出有机溶剂(ADD冷阱自动排液功能);

3) 真空度降至8mbar,快速蒸发大部分水;

4) 关闭红外灯,极低的真空度下使样品冷冻变成固态;

5) 在全真空下加热一定时间以加速升华;

6) 最后在全真空不加热的条件下直至样品完全冷冻干燥。


 

4:快速冻干过程

Lyospeed法比只用冻干的方法速度更快,同时比只用蒸发的方法得到更加干燥和蓬松的样品。


4、案例分享

15ml 0.01M 布洛芬钠盐溶液溶解在40%乙腈水混合物中并装入20ml闪烁瓶,使用Lyospeed技术平衡浓缩和冻干过程,在HT系列溶剂蒸发工作站进行快速冻干。下图显示传统离心浓缩样品与快速冻干样品之间的差异,快速冻干的样品更加蓬松,更利于样品的复溶。

 

5:传统蒸发结果  


 

6:快速冻干结果


Lyospeed技术兼容EZ-2 4.0 Elite离心浓缩系统和Genevac HT 3i系列溶剂蒸发工作站,由足够好的无油真空泵、自动除霜和排液的冷阱以及一个灵活、可编辑方法的软件组成。

 

EZ-2 4.0 Elite离心浓缩系统 

 

HT 3i系列溶剂蒸发工作站


参考文献:

Genecac_TechArticle_Drying of Problematic Purification Samples by Lyophilisation in a Centrifugal Evaporator - with “Fluffy” Results